下面，我们来看一下如何利用GEO数据库中的芯片数据进行后续剖析。
GEO数据库的简介
GEO数据库，GENE EXPRESSION OMNIBUS，是由美国国立生物技能信息中央NCBI创建并掩护的基因表达数据库（官网：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。
它最初创建于2000年，紧张用于收录各国研究机构提交的高通量基因表达数据，也便是说只假如在目前已经揭橥的绝大部分论文中，其涉及到的基因表达检测的数据，包括芯片数据，二代测序结果，以及其他形式的高通量检测结果，都可以通过这个数据库中找到。
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首先，我们进入GEO数据库中，根据GSE编号，查看一下该数据的一些干系信息。在搜索栏中输入编号，“GSE39582”，然后点击“Search”按钮，进行检索。
当然，熟习了往后，我们也可以直接输入网址进行快速检索，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE39582；对付检索页面网址而言，其前面是一样的，唯一的差异是acc=后面的GSE编号，修正编号，可以快速进入对应的结果页面，这样也可以在一定程度上减少由于网速等缘故原由所带来的阻碍。
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在结果页面中，我们可以初步看一下该结果对应的发布韶光，题目，物种等信息。同时，Experiment type中Expression profiling by array表示该结果是通过芯片得到的表达谱；Overall design中大略先容了全体研究的设计方案和分组信息。
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GEO数据的下载
当得到了芯片的GSE编号后，我们接下来须要将其对应的数据进行下载，从而根据自己的须要进一步剖析。关于数据的下载，我们这里紧张先容三种不同的方法。
方法一：下载芯片的原始数据
在检索页面中，一起下拉；在Supplementary file中点击Download中的custom，展开原始数据对应列表；点击“Select all“，然后点击Download，即可将所有样本的原始数据RAW Data文件下载；
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虽然这是最直接的方法，但是RAW Data文件相对较大，对下载的网速哀求相对较高，而且不同的芯片来源，有不同的处理方法，乃至有些芯片没有处理方法，由于其是对应定制的。以是，一样平常情形下，不推举大家下载原始数据。
方法二：下载表达矩阵（series matrix）
在Download family中点击Serier Matrix File(s)，进入下载页面；
待下载完成后，可以直策应用read.table()函数读取进来。
可以看到，在芯片中，包含了54675个基因探针，586个患者。
方法三：利用R的GEOquery包里面的getGEO()函数直接读取进来（推举）
当然，考虑到网速问题，我们可以对参数进行设置，选择不下载平台的注释文件，由于一样平常来讲注释文件是相比拟较大的。
如果把之前下载的series Matrix文件放在当前目录下，getGEO()函数会直接检测到该文件，并进而直接将其进行读取；
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我们可以直接查看一下下载结果gset的变量类型。
可以看到，变量gset是一个列表的形式。
为什么是list格式呢？由于一个GEO芯片项目，是可以对应多个芯片平台的，那么每个平台的数据结果会对应list里面的一个元素。
既然是列表，自然可以提取个中的第一个元素出来查看一下。可以看到，个中展示了包含了6个样本，33297个特色，以及干系的临床信息，PMID号，以及注释平台信息。
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提取表达和临床信息
3.1 通过pData函数获取分组信息
通过pData()函数，即可提取表达数据中的临床信息；同时，点击Environment中的pdata查看，我们可以查看里面的干系信息。可以看到，个中，非肿瘤的样品19例。
因此，根据临床信息，我们可以对样品进行分组，分为肿瘤组和正常组；
终极，得到正常组19例样品，肿瘤组566例样品。
3.2 通过exprs()函数获取表达矩阵并校正
整理完临床信息后，我们须要提取对应的表达数据。对付表达数据，除了下载Series Matrix后直策应用read.table()函数进行读取外，我们也可以直接从GEOquery下载得到的变量gset中进行提取。
利用exprs()函数可以从gset[[1]]提取表达信息；同时，我们可以利用boxplot()函数先大略看一下整体样本的表达情形。
由于每一次技能重复的时候，都会有偏差，芯片的原始数据是由仪器读取的，不同的读取韶光，或者扫描仪光芒的强弱都会导致同一类型的样本涌现偏差。正式剖析前，我们须要对其进行人工校正一下。这里我们用limma包内置的一个函数，
normalizeBetweenArrays()函数。
可以看到，经由校正，全体表达水平基本趋于同等。
此外，利用range()函数查看一下表达数据exp的取值范围；一样平常而言，范围在20以内的表达值基本已经经由了log对数转换。
ID变换
整理好了表达矩阵往后，我们须要将探针的id转换成为基因的Gene symbol。对付探针id的转换过程，目前紧张是通过R包来进行转换。接下来，我们来看一下如何进行芯片探针id的转换过程。
方法一：利用R包转换
随着芯片平台的普遍利用，其基因的注释信息也被整理成了不同的R包；因此，常日情形下我们利用R包来注释。不同的平台，对应着不同的R包。首先，我们来看一下这个数据集利用的平台类型。
通过提取列表gset[[1]]中的注释信息，可以看到，该芯片利用的是我们最常见的平台，GPL570。
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对付GPL570，其对应的R包是hgu133plus2.db包；查找显示，其储存在Bioconductor中，下载并进行安装R包。
首先，我们来看看，在hgu133plus2.db包中，包含了哪些信息；
可以看到，除了Symbol信息外，在个中还包含了Ensemble id，Entrez id等信息，可以须要进行提取。
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提取个中的Symbol信息，可以看到，终极得到了probe id和Gene symbol的对应信息。
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个中，经由去重复，一共存在20174个不同的Gene symbol，且部分基因存在多条探针的对应关系。
接下来，我们须要将其进行逐一对应匹配。
经由id匹配，并去重复，终极得到了20174个基因的表杀青果；
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同时，我们可以查看一下前3行前3列的表达情形。
当然，除了R包注释外，还有其他的注释方法，比如利用网页下载的soft文件进行注释，或者有些分外的芯片内容，须要自己手工比对注释。
方法二：利用soft文件注释
方法三：手工注释
PCA剖析
表达矩阵到此基本整理完成。接下来，在正式的差异剖析之前，我们首先可以做一个PCA剖析，整体水平查看正常和肿瘤两组样品直接是否存在显著的差异。
结果显示：在该芯片中，癌和癌旁组织的表达水平存在一定的差异。
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差异剖析
对付芯片数据的差异剖析，我们一样平常利用limma包来进行。关于差异剖析的输入文件，紧张是两个，第一是整理好的表达矩阵，个中行名为基因名，列名为样本名；第二是分组信息（group list）。
终极，利用topTable()函数提取所有基因的差异剖析。
可以看到，在结果表格中，包含了6块的内容，包括我们常见的logFC值，以及P.Value，adj.P.Val等等。
接下来，我们须要根据设定的阈值，｜logFC｜>1.5和P值
可视化剖析
1、火山图
对付差异剖析结果，火山图和热图是两种最常见的展示办法。首先，我们来看一下火山图的绘制方法。对付火山图的绘制，大家可以参考之前的推文（生信最主要的图之一，十分钟帮你搞定！
建议收藏！
！
）。
方法一：基于ggpubr包绘制火山图
结果显示：
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接下来，我们可以进一步给火山图添加标签，把显著上调和显著下调基因中前5名的基因名进行标注；
结果显示：
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方法二：基于ggplot2包绘制火山图
结果显示：
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当然，我们也可以对其进行添加标签的操作；
结果显示：
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2、热图
提取差异表达基因的表达情形；
结果显示：
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到此，GEO数据库芯片数据的下载，probe id的转换，差异剖析已经基本完成了，全体文章中最难的80%内容也已经基本办理。接下来，便是针对这些差异基因的常规剖析，包括GO剖析，KEGG剖析，GSEA剖析，蛋白-蛋白互作网络（Protein-protein interaction，PPI）。
