虎杖治疗肺动脉高压浸染机制的收集药理学研究_成分_活性

作者：余志杰，陈 兴，左建丽，何 瑶，郑姣妮，郑晓媛△

（重庆市第四公民医院·重庆市急救医疗中央药剂科，重庆 400014）

择要：目的 磋商虎杖药材治疗肺动脉高压（PAH）的浸染机制。
方法 通过中药系统药理学数据库和剖析平台（TCMSP）和PubMed检索虎杖活性身分，构建活性身分库。
通过TCMSP 获取活性身分的潜在靶点，利用Uniprot 数据库获取潜在靶基因。
利用人类基因数据库（GeneCards）和人类孟德尔遗传数据库（OMIM）筛选PAH 致病靶点与活性身分靶点基因，构建“药物-活性身分-疾病靶点”可视化网络。
将潜在靶点导入String 数据库，构建蛋白-蛋白相互浸染（PPI）网络；利用DAVID 数据库将潜在靶点进行基因本体论（GO）功能富集剖析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集剖析。
将节点度值排名前7 的活性身分与排名前6 的核心靶点利用AutoDock Tools 和PyMOL 软件进行分子对接和可视化剖析。
结果 筛选出活性身分39 个，对应靶基因323 个，与PAH 共同靶点138 个。
经PPI 网络剖析，个中关键靶点涉及AKT1，VEGFA，TNF 等；GO 功能富集剖析紧张涉及低氧反应、炎性反应、血管再生等功能；KEGG通路富集剖析紧张涉及细胞增殖、细胞凋亡、炎性反应等旗子暗记通路；分子对接结果表明，虎杖药材活性身分白藜芦醇、木犀草素与AKT1，大黄素、芹黄素与TNF 均有较好的亲和力。
结论 虎杖药材可通过多种浸染机制预防和治疗PAH。

关键词：网络药理学；虎杖；肺动脉高压；浸染机制；分子对接

肺动脉高压（PAH）是由于肺血管狭窄或阻力增加引起的肺动脉压力非常增高的慢性疾病，具有肺血管重构和肺血管阻力增加的显著病理特色，后期可发展为右心衰竭乃至去世亡［1］。
PAH 的发病机制涉及多种成分，紧张包括遗传变异、血管细胞的非常增殖、代谢障碍、炎性及免疫反应［2-4］。
与预后不良程度干系的成分包括性别、年事、PAH 分级、右心室功能障碍干系指标、结缔组织病等。
约50%患者去世于右心衰竭引起的循环衰竭。
PAH 特异性治疗药物包括前列环素通路激动剂、内皮素受体拮抗剂、一氧化氮- 环磷酸鸟苷增强剂及钙通道阻滞剂（少用）［5-6］，但这些药物的利用均缺少大型、多中央临床试验支持。
虎杖为蓼科植物虎杖Polygo⁃num cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根和茎，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰功效，紧张用于湿热黄疸、风湿痹痛、肺热咳嗽等的治疗［7］。
虎杖药材具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗病毒、调血脂、抗肿瘤、抗氧化、扩血管等［8］。
研究证明虎杖的活性身分白藜芦醇和虎杖苷对PAH 模型大鼠均具有保护浸染。
白藜芦醇紧张通过MAPK/ERK1 及PI3K/AKT 旗子暗记通路发挥抗炎抗血管非常增生浸染，而虎杖苷对PAH 的浸染机制研究较缺少［9-10］。
前期研究创造，虎杖提取物及其活性身分虎杖苷可改进高脂饮食勾引的动脉粥样硬化及抑制血管平滑肌细胞增殖［11］。
网络药理学基于中药多身分- 多靶点- 多路子思维，研究中药或复方治疗疾病的物质根本及潜在浸染靶点和机制，对阐明中医药理论“整体不雅观”的思想供应了主要借鉴［12-13］。
本研究中基于该方法磋商了虎杖药材治疗PAH 的潜在活性身分及浸染机制，利用分子对接技能验证虎杖药材中活性身分与浸染靶点的结合性能，从而为开展虎杖药材治疗PAH 详细浸染机制的体内体外实验供应科学依据。
现宣布如下。

1 资料与方法

1.1 潜在治疗靶点得到

利用中药系统药理学数据库和剖析平台（TCMSP），以“虎杖”为关键词搜索其活性身分，将口服生物利用度（OB）及类药性（DL）作为筛选参数，设OB > 30%，DL>0.18，筛选并构建活性身分库，并检索PubMed数据库网络已证明的虎杖干系活性身分，共同纳入该库。
再利用TCMSP 数据库获取虎杖活性身分的潜在靶点，并通过Uniprot 数据库将靶点蛋白名称标准化，选择物种“Homo sapiens”（下同），转换为对应的基因名称，即得虎杖活性身分化合物库的潜在浸染靶点基因。

利用人类基因数据库（GeneCards）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM）以Relevance score ≥5.0为筛选条件。
筛选PAH 干系致病靶点，搜索英文关键词“Pulmonary hypertension”“Pulmonary arterial hypertension”，得到与PAH干系的靶点。

取GeneCards，OMIM 及虎杖活性化合物靶点的交集，得到虎杖活性化合物治疗PAH的潜在靶点。

1.2 网络构建

将1.1 项结果导入Cytoscape 3.7.1 软件构建药物（虎杖）- 活性身分- 靶点网络关系图；节点（Node）代表中药、潜在活性身分及靶点，边（Edge）代表节点间的相互联系，节点度（Degree）值越大，节点越主要；通过String 数据库获取靶点的蛋白-蛋白相互浸染（PPI）关系，再通过Cytoscape 3.7.1 软件的Network analysis功能进行网络拓扑学剖析，并通过靶点的节点度值构建PPI网络。

1.3 目标基因富集剖析

利用DAVID 数据库剖析挖掘虎杖活性身分潜在浸染靶点的生物注释功能信息，进行基因本体论（GO）富集剖析，包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3个部分。
将虎杖活性身分对PAH的潜在浸染靶点导入Functional annotation中，在结果中选择并导出GO富集剖析中的BP，CC，MF，设定缺点创造率（FDR）<0.05且P<0.01，筛选虎杖活性身分浸染靶点显著富集的紧张功能注释及体内通路，将排名靠前的富集结果可视化绘制为条形图；利用Metascape 数据库中的基因富集剖析工具，将虎杖活性身分浸染靶点的Uniprot ID导入个中，进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集剖析，获取虎杖治疗PAH的浸染通路，以FDR<0.05且P<0.01为筛选条件，并可视化排名前20的旗子暗记通路。

1.4 分子对接

利用PubChem 数据库下载节点度值排名靠前的活性身分槲皮素、白藜芦醇、囊毒碱、木犀草素、大黄素、芹黄素、虎杖苷的3D 构造，利用RCSB PDB 蛋白数据库下 载 核心靶点AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR（蛋白质ID 分别为6HHG，1BJ1，1A8M，2ZOQ，4KVP，4KRM）的3D 构造。
利用AutoDock Tools 1.5.6 软件进行分子对接获取最佳结合能，结果用PyMOL 软件进行可视化剖析。

2 结果

2.1 潜在治疗靶点

共得虎杖活性身分39 种，详见表1。
并据此得到对应的潜在靶点，去重后通过标准化转换，得虎杖有效身分的靶基因共323个。

表1 虎杖活性身分

Tab.1 The active components of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

经GeneCards 数据库筛选得2874 个靶基因，经OMIM数据库筛选得5343个靶基因。

将上述靶基因与虎杖活性化合物靶点取交集，得虎杖活性化合物治疗PAH 的潜在靶点138 个。
详见图1。

图1 潜在靶点Fig.1 Potential targets

2.2 网络构建

2.2.1 药物-活性身分-疾病靶点网络

共得178 个节点，个中1 个中药节点，39 个化合物节点，138 个靶点节点，共2 356 条边。
靶基因中节点度值排名靠前的为AKT1，PTGS2，TNF，VEGFA，TP53，MAPK8，EGF，CASP3，MAPK3，EGFR 等，而活性身分槲皮素、白藜芦醇与靶基因的连接数均超过68，可能为虎杖改进PAH 的紧张核心身分。
此外，虎杖的不同活性身分可浸染于同一靶点，而同一活性身分又可浸染于不同靶点，表示出虎杖治疗PAH 多身分- 多靶点的协同浸染特点。
详见图2。

图2 药物-活性身分-疾病靶点网络关系图

Fig.2 PPI network of traditional Chinese medicines-active components-disease targets

2.2.2 PPI 网络

138 个靶蛋白间的PPI 网络，节点颜色越红表示节点的节点度值越高，靶点主要性越大，见图3。
节点度值> 60 且 排 名 前23 的 靶 点 为AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR，MAPK8，CASP3，PTGS2，MAPK1，STAT3，MYC，MMP9，EGF，IL-1β，CCL2，IL-10，MMP2，ESR1，FGF2，PPARG，PTEN，ERBB2。
详见表2。

表2 节点度值排名前23的核心靶点

Tab.2 The top 23 key targets with degree value

图3 PPI网络图 Fig.3 PPI network

2.3 GO 功能富集剖析与KEGG 通路富集剖析

共富集到16 条BP，15 项CC，15 项MF，见图4。
个中BP 紧张富集在基因表达的正调控、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对脂多糖的反应等；CC紧张富集在细胞间隙、质膜、胞外区、线粒体等；MF 紧张富集在细胞因子活性、转录因子结合、成长因子活性等。

P 值排名前20 的旗子暗记通路见图5，靶点紧张富集在PI3K/AKT 旗子暗记通路、TNF 旗子暗记通路、MAPK 旗子暗记通路、HIF - 1 旗子暗记通路、FOXO 旗子暗记通路及凋亡干系旗子暗记通路，上述通路分别涉及细胞的增殖生存调控、炎性反应、细胞周期、凋亡及自噬等在低氧刺激下HIF-1旗子暗记通路的激活与PAH 的发病机制干系。
KEGG 旗子暗记通路见图6。

图5 KEGG通路富集剖析结果

图6 KEGG旗子暗记通路图

2.4 分子对接

虎杖活性身分（槲皮素、白藜芦醇、囊毒碱、木犀草素、大黄素、芹黄素、虎杖苷）与核心靶点（AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR）的对接结果见表3。
7个活性身分结合AKT1 所需的能量总体较低，因此推测虎杖的活性身分可能紧张浸染于AKT1。
此外，大黄素、芹黄素与TNF 的结合能，白藜芦醇、木犀草素与AKT1 的结合能均较低，表现出良好的亲和力。
其详细的分子对接模式见图7（绿色：配体；黄色：氨基酸残基；虚线：氢键）。

表3 活性身分与核心靶点分子对接结果

Tab.3 Results of molecular docking between active components and key targets

3 谈论

网络药理学是基于系统生物学理论，通过构建药物、基因、疾病相互间浸染的网络关系，从节点和靶点间的相互浸染强度探究药物潜在浸染机制和药物设计的一门新兴学科［14］。
网络药理学不仅揭示了中药治疗疾病的潜在活性身分和详细的浸染靶点，而且可为阐明中医药治疗疾病的多身分-多靶点-多路子的浸染特点供应主要的研究方法［15］。
本研究结果表明，虎杖的关键活性身分（大黄素、芹黄素、白藜芦醇、木犀草素）紧张靶向AKT1、TNF 等靶点，调控PI3K/ AKT、TNF、MAPK 等旗子暗记通路，通过影响细胞增殖、凋亡、炎性反应等生物过程，从而改进PAH。

通过“药物- 活性身分- 靶点”网络关系图可知，AKT1，PTGS2，TNF，VEGFA，TP53，MAPK8，EGF，CASP3，MAPK3，EGFR 靶点与活性身分连接数较高，同时PPI网络关系图也证明了AKT1，TNF，MAPK3，VEGFA，TP53，EGFR 为核心靶点，表明虎杖的活性身分可能紧张靶向上述靶点发挥抗PAH 的浸染。
GO 功能富集剖析结果显示，其BP紧张富集在基因表达的正调控、炎性反应、调节血管天生、缺氧反应、细胞增殖及凋亡过程。
有研究已证明，AKT1 经PI3K 的磷酸化而激活，紧张参与PI3K/ AKT 旗子暗记通路调节细胞增殖与生存［16］。
同时TNF，MAPK3 引起的炎性反应在PAH 的发生机制中也被证明［17-18］。
在血管内皮细胞的体外实验中也创造VEGFA 和EGFR 的非常表达与PAH 密切干系［19-20］。
FENG 等［21］的研究结果显示，TP53 可调控人肺动脉平滑肌细胞（HPASMC）的细胞周期及凋亡从而抑制PAH。
此外，KEGG 通路富集剖析结果也显示，虎杖紧张通过PI3K/AKT 旗子暗记通路、TNF 旗子暗记通路、MAPK 旗子暗记通路、HIF - 1 旗子暗记通路、FOXO 旗子暗记通路及凋亡干系旗子暗记通路影响PAH，上述多条旗子暗记通路相互影响，如TNF 可激活下贱的NF - κB、MAPK 旗子暗记通路，促进炎性因子表达，从而导致炎性反应。
ZHU 等［22］的研究结果表明，在野百合碱勾引的PAH 模型大鼠中MAPK/NF-κB旗子暗记通路被明显激活。
同时，PI3K/AKT 旗子暗记通路不仅能促进平滑肌细胞增殖导致肺血管重构，而且也能调控下贱NF - κB 旗子暗记通路介导的炎性反应。
此外，TGF 浸染于EGFR受体可勾引下贱细胞增殖基因FOS，MYC，JUN的表达，从而上调VEGF 及MMPs 的表达引发血管的增生和重构。
研究证明，低氧可勾引HPASMC上调HIF-1α表达，激活HIF - 1 旗子暗记通路，导致EGF/VEGF 的非常表达［23］。
同时，VEGF 也可浸染于VEGFR2 受体激活PI3K/ AKT 旗子暗记通路，抑制CASP9 和Bcl - 2 的表达从而勾引凋亡，并且EGF与其受体结合可激活FOXO旗子暗记通路从而影响细胞周期。

A.BP B.CC C.MF 图4 GO功能富集剖析结果

Fig.4 The results of GO function enrichment analysis

A.大黄素+ TNF B.芹黄素+ TNF C.白藜芦醇+ AKT1 D.木犀草素+ AKT1

图7 分子对接中结合能较低的结果

A.Emodin+TNF B.Apigenin+TNF C.Resveratrol+AKT1 D.Luteolin+AKT1

Fig.7 The results with lower binding energy in molecular docking

为进一步证明虎杖活性身分与核心靶点结合的亲和力，通过分子对接技能验证槲皮素、白藜芦醇、囊毒碱、木犀草素、大黄素、芹黄素、虎杖苷与核心靶点AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR 的结合性能，结果表明，7 个活性身分均与6 个核心靶点表现出良好的结合能，结合能较低的为芹黄素与TNF（-6.96 kcal/mol），而且这些活性身分与AKT1 的亲和力优于其他靶点，证明虎杖的活性身分可能紧张靶向AKT1，从而通过影响血管细胞的成长与增殖引起血管重构。
本研究中选择的虎杖活性身分的不同点在于，还从PubMed 数据库中检索已证明的虎杖活性身分（如虎杖苷），共同纳入虎杖活性身分库，从而避免遗漏。
此外，有研究已证实在低氧勾引的PAH 模型大鼠中，虎杖苷可通过调节一氧化氮、内皮素的含量改进PAH，但其详细浸染机制仍需进一步研究［10］。
因此，本课题组后期的体外实验会重点研究虎杖苷、槲皮素、白藜芦醇、囊毒碱、木犀草素、大黄素、芹黄素对低氧勾引肺动脉平滑肌细胞的影响，及其对AKT1 和VEGFA 靶点的调节浸染，从而证明虎杖药材治疗PAH的详细活性物质和浸染机制。

综上所述，本研究中通过网络药理学和分子对接技能预测虎杖药材防治PAH的潜在活性身分和核心靶点，为虎杖药材的临床运用供应了一定参考。

参考文献

［1］KOUDSTAAL T，BOOMARS KA，KOOL M.Pulmonary arterial hypertension and chronic thromboembolic pulmonary hyperten‑sion：an immunological perspective［J］.J Clin Med，2020，9（2）：561.

［2］THENAPPAN T，ORMISTON ML，RYAN JJ，et al.Pulmonary arterial hypertension：pathogenesis and clinical management［J］.BMJ，2018，360：j5492.

［3］PULLAMSETTI SS，SAVAI R，JANSSEN W，et al.Inflamma‑tion，immunological reaction and role of infection in pulmonary hypertension［J］.Clin Microbiol Infect，2011，17（1）：7-14.

［4］SCHERMULY RT，GHOFRANI HA，WILKINS MR，et al.Mechanisms of disease：pulmonary arterial hypertension［J］.Nat Rev Cardiol，2011，8（8）：443-455.

［5］GOLDBERG AB，MAZUR W，KALRA DK.Pulmonary hyper‑tension：diagnosis，imaging techniques，and novel therapies［J］.Cardiovasc Diagn Ther，2017，7（4）：405-417.

［6］中华医学会呼吸病学分会肺栓塞与肺血管病学组，中国医师协会呼吸医师分会肺栓塞与肺血管病事情委员会，全国肺栓塞与肺血管病防治协作组，等.中国肺动脉高压诊断与治疗指南（2021 版）［J］.中华医学杂志，2021，101（1）：11-51.

［7］国家药典委员会.中华公民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2020：217-218.

［8］时圣明，潘明佳，王文倩，等.虎杖的化学身分及药理浸染研究进展［J］.药物评价研究，2016，39（2）：317-321.

［9］XU D，LI Y，ZHANG B，et al.Resveratrol alleviate hypoxic pul‑monary hypertension via anti - inflammation and anti - oxidant pathways in rats［J］.Int J Med Sci，2016，13（12）：942-954.

［10］MIAO Q，SHI XP，YE MX，et al.Polydatin attenuates hypoxic pulmonary hypertension and reverses remodeling through pro‑tein kinase C mechanisms［J］.Int J Mol Sci，2012，13（6）：7776-7787.

［11］马 渝.虎杖及其提取物对兔动脉粥样硬化模型的干预影响［D］.重庆：重庆医科大学，2003.

［12］LI S，ZHANG B.Traditional Chinese medicine network phar‑macology：theory，methodology and application［J］.Chin J Nat Med，2013，11（2）：110-120.

［13］MUHAMMAD J，KHAN A，ALI A，et al.Network Pharmacology：Exploring the Resources and Methodologies［J］.Curr Top Med Chem，2018，18（12）：949-964.

［14］HOPKINS AL.Network pharmacology：the next paradigm in drug discovery［J］.Nat Chem Biol，2008，4（11）：682-690.

［15］ZHOU Z，CHEN B，CHEN S，et al.Applications of Network Pharmacology in Traditional Chinese Medicine Research［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2020，2020：1646905.

［16］HERS I，VINCENT EE，TAVARÉ JM.Akt signalling in health and disease［J］.Cell Signal，2011，23（10）：1515-1527.

［17］HASSOUN PM，MOUTHON L，BARBERÀ JA，et al.Inflam‑mation，growth factors，and pulmonary vascular remodeling［J］.J Am Coll Cardiol，2009，54（1 Suppl）：s10-s19.

［18］ZHU Y，SUN Y，ZHANG S，et al.Xinmai'an extract enhances the efficacy of sildenafil in the treatment of pulmonary arterial hypertension via inhibiting MAPK signalling pathway［J］.Pharm Biol，2021，59（1）：594-605.

［19］LIU J，WANG W，WANG L，et al.IL - 33 Initiates Vascular Remodelling in Hypoxic Pulmonary Hypertension by up -Regulating HIF-1α and VEGF Expression in Vascular Endo‑thelial Cells［J］.EBioMedicine，2018，33：196-210.

［20］YU XF，ZHAO XJ，ZHANG JT，et al.Dacomitinib，a new pan-EGFR inhibitor，is effective in attenuating pulmonary vascular remodeling and pulmonary hypertension［J］.Eur J Pharmacol，2019，850：97-108.

［21］FENG Q，TIAN T，LIU JF，et al.Deregulation of microRNA -31a - 5p is involved in the development of primary hyperten‑sion by suppressing apoptosis of pulmonary artery smooth mus‑cle cells via targeting TP53［J］.Int J Mol Med，2018，42（1）：290-298.

［22］ZHU N，ZHAO XY，XIANG YJ，et al.Thymoquinone attenu‑ates monocrotaline - induced pulmonary artery hypertension via inhibiting pulmonary arterial remodeling in rats［J］.Int J Cardiol，2016，221：587-596.

［23］WANG J，FU X，YANG K，et al.Hypoxia inducible factor-1-dependent up - regulation of BMP4 mediates hypoxia - in‑duced increase of TRPC expression in PASMCs［J］.Cardio‑vasc Res，2015，107（1）：108-111.

Mechanism of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the Treatment of Pulmonary Arterial Hypertension Based on Network Pharmacology

YU Zhijie，CHEN Xing，ZUO Jianli，HE Yao，ZHENG Jiaoni，ZHENG Xiaoyuan

（Department of Pharmacy，Chongqing Fourth People′s Hospital · Chongqing Emergency Medical Center，Chongqing，China 400014）

Abstract：Objective To investigate the mechanism of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix in the treatment of pulmonary arterial hypertension （PAH）.Methods The active components of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix were searched through the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） and PubMed to construct the database of active components.The potential targets of active components were obtained by the TCMSP，and the potential target genes were obtained by the Uniprot database.The pathogenic targets of PAH and target genes of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix were screened through the GeneCards and Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM） databases to construct the"traditional Chinese medicine - active components- disease target" visual network.The potential targets were imported into the String database to construct the protein - protein interaction（PPI）network.Gene Ontology（GO）function enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis were conducted on the potential targets through the DAVID database.Molecular docking and visual analysis were conducted on the active components ranking the top sever in the Degree value and the key targets ranking the top six through AutoDock tools and PyMOL software.Results Thirty - nine active components were screened from Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix，including 323 corresponding target genes and 138 common targets corresponded with PAH.PPI network analysis showed that the key targets involved AKT1，VEGFA，TNF and so on.Go function enrichment analysis mainly involved hypoxic response，inflammatory response，vascular regeneration and other functions.KEGG pathway enrichment analysis mainly involved signaling pathways such as cell proliferation，apoptosis and inflammatory response.Molecular docking results showed that resveratrol and luteolin had a good affinity with AKT1，emodin and apigenin had a good affinity with TNF.Conclusion Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix can prevent and treat PAH through a variety of mechanisms.

Key words：network pharmacology；Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix；pulmonary arterial hypertension；mechanism；molecular docking

中图分类号：R932；R285

文献标志码：A

文章编号：1006-4931（2022）12-0053-07

doi:10.3969/j.issn.1006-4931.2022.12.013

基金项目：重庆市技能创新与运用示范项目［cstc2018jscx - msybX0172］；重庆市卫生存生委医学科研项目［2017ZDXM023］；重庆市渝中区科技操持项目［20170132］。

第一作者：余志杰，男，硕士，药师，研究方向为中药药理学。

△通信作者：郑晓媛，女，硕士，副主任药师，研究方向为药理学及医院药学

（收稿日期：2021-10-09；修回日期：2021-12-23）