随着人口老龄化的加剧，中国PCa发病率呈现快速增长趋势，与1990年比较，2019年中国PCa的新发病率增长了481.06%。
PCa的发生与雄激素水平密切干系，现阶段常用雄激素剥夺疗法治疗PCa，取得了较好的效果，然而部分PCa患者仍会在治疗后复起事堪以治愈的去势抵抗性PCa，乃至因发生骨转移而去世亡。
目前，有关去势抵抗性PCa发生发展的详细分子机制仍不明确。
Krüppel样因子7(Krüppel-likefactors，KLF7)是转录因子KLFs家族成员之一，广泛参与脂分解以及糖、脂代谢旗子暗记通路的调控。
DeDonato等创造，KLF7高表达与高等别浆液性卵巢癌的不良预后有关。
Gupta等创造，KLF7可能通过调控趋化因子的分泌促进胰腺导管腺癌细胞的成长和转移。
有关KLF7与PCa发生发展的关系尚罕见宣布。
前期研究创造，KLF7在PCa组织中显著高表达，提示转录因子KLF7可能参与PCa的发生和发展，而详细分子机制有待进一步明确。
本研究在网络PCa组织以及体外培养去势抵抗性PCa细胞PC-3的根本上，磋商KLF7是否通过转录激活转化成长因子-α(transforminggrowthfactorα，TGF-α)，促进PC-3细胞的生物学行为。
以血清游离前列腺特异性抗原(freeprostatespecificantigen，FPSA)>3.5μg/L为筛选条件，结合临床病理学穿刺结果，网络2017-09-01-2019-09-31在新疆石河子市公民医院确诊为PCa的患者肿瘤组织切片10例。
在严格匹配患者的年事，并打消各种肿瘤及恶性花费性疾病的影响之后，在石河子市公民医院网络同期10例前列腺增生(benignprostatichyperplasiaBPH)组织为对照组。
经石河子大学医学院第一附属医院伦理审查委员会的审核与批准(2017-049-01)，经患者签署知情赞许书后在病理科调取受试个体的石蜡组织标本切片。
人PCa细胞PC-3与293T细胞购自中国科学院范例培养物宝藏委员会细胞库。
F12培养基购自美国Gibco公司，DMEM培养基、胎牛血清以及胰蛋白酶均购自以色列BiologicalIndustries公司。
KLF7和TGF-α抗体购自美国Abcam公司，β-actin抗体购自北京中衫金桥生物技能有限公司。
根本电泳仪和蛋白转膜仪电源购自美国Bio-Rad公司，高速冷冻离心机和直热式CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司，颠倒荧光显微镜购自日本Nikon公司，实时定量PCR仪购自德国QIAGBN公司，超纯水系统购自美国Milli-Q公司，电子剖析天平购自北京赛多利斯公司。
CCK-8为日本同仁化学研究所产品。
在60℃烘箱中烤片30min后，迅速将切片依次浸入体积分数为100%二甲苯和无水、体积分数为90%、80%及70%乙醇中脱蜡5min;利用高压修复法在EDTA修复液中修复抗原8min，待冷却至室温后利用体积分数为3%双氧水避光浸泡10min，利用PBS缓冲液洗濯切片3次；分别滴加KLF7抗体(abcam，ab197690，1∶200)与TGF-α抗体(abcam，ab208156，1∶4000)，并置于4℃孵育过夜；37℃复温30min后，利用PBS缓冲液洗濯切片3次，滴加二抗(山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)并置于37℃孵育30min;利用PBS缓冲液洗濯切片3次，滴加DAB显色后利用净水终止显色；将切片置于苏木精中染色3min后净水洗濯切片并脱水封片。
请2位病理学教授对组织进行免疫组化评分。
阳性强度：无色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3。
评分阈值设置为0.1，评分<0.1为阴性，≥0.1为阳性。
此外，对付阳性病例设置了另一个阈值，定义为免疫阳性肿瘤细胞>50%。
PC-3细胞利用F12培养基+体积分数为10%胎牛血清+体积分数为1%青霉素-链霉素稠浊液(青霉素100U/mL，链霉素100mg/L)，常规培养于含体积分数为5%CO2的37℃培养箱内。
293T细胞利用高糖DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素稠浊液(青霉素100U/mL，链霉素100mg/L)，常规培养于含5%CO2的37℃培养箱内。
Trizol法提取细胞内总RNA，去除rRNA后逆转录为cDNA。
末端修复后加测序接头完成文库制备并扩增，检测文库质量与浓度后在llluminaHiSeqXTen平台中进行双端测序；利用Trimmomatic0.38软件对原始测序数据进行过滤剖析，得到高质量数据后与参考基因组进行比对；筛选出多数样本中稳定表达的基因后对其进行标准化处理，随后利用R3.6.2DESeq2包对上(下)调KLF7组与对照组进行差异表达剖析，以P<0.05且|log2(FC)|>1作为条件筛选出差异表达基因。
将细胞接种于6孔板中，待细胞成长密度达50%时，利用无血清F12培养液分组配置Lipo2000pcDNA3.1(+)KLF7质粒(OE-KLF7组)、Lipo2000pcDNA3.1(+)TGF-α质粒(OE-TGF-α组)、Lipo2000pcDNA3.1(+)NC(OE-NC组)稠浊液，和Lipo2000KLF7-homo(si-KLF7组)、Lipo2000KLF7-homo(si-TGF-α组)、Lipo2000NC-homo(si-NC组)稠浊液，分别上调KLF7、TGF-α表达和滋扰KLF7、TGF-α表达，培养箱中孵育转染4h后吸出细胞中转染稠浊液，并加入含FBS的完备培养基连续培养48h待用。
Trizol法提取细胞总RNA，利用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit法反转录为cDNA，末了QuantiNovaTM SYBRGreenPCRKit法检测细胞中KLF7、TGF-α的mRNA表达水平。
设置空缺对照组为1，各分组的KLF7、TGF-α的表达水平为空缺对照组的倍数。
mRNA表达水平=2-△△Ct
Ct=单样本△Ct-本组所有样本△Ct均匀值
Ct=单靶基因Ct-单样本GAPDHCt
Human-KLF7引物序列分别为5′-CTCAATGGTGGTGCTTGCTT-3′、5′-TGGAAAACCTGCTC-GCTCTA-3′，大小为233bp;Human-TGF-α引物序列分别为5′-AGGTCCGAAAACACTGTGAGT-3′、5′-AGCAAGCGGTTCTTCCCTTC-3′，大小为87bp;Human-GAPDH引物序列分别为5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAA-3′、5′-TCTTCCTCTTGTGCTC-TTGCT-3′。
si-KLF7引物序列分别为5′-GCCUUGAAUUGGAACGCUATT-3′和3′-UAGCGUUCCAAUUCAAGGCTT-5′，si-TGF-α引物序列分别为5′-GCUGUCCUUAUCAUCACAUTT-3′和3′-AUGUGAUGAUAAGGACAGCTT-5′。
加入RIPA+PMSF蛋白裂解液提取细胞总蛋白质，利用BCA法检测蛋白质浓度并调平。
4×loadingbuffer加入相对量蛋白质(1∶3)并100℃干浴10min。
依次电泳、电转后置于BSA封闭3h，滴加抗体稀释液于4℃孵育过夜，洗膜后在二抗稀释液(山羊抗鼠/兔为1/10000)中常温孵育2h，再次洗膜后暗室曝光。
曝光结果进行灰度扫描，打算目的条带灰度值/内参条带灰度值。
在6孔板等分组处理PC-3细胞后，利用EDTA-胰蛋白酶将处于80%成长密度的各分组PC-3细胞消化计数后，以1.5×104个/孔的密度重悬接种于96孔板。
细胞经24h贴壁后，重新设置0、24、48、72h并在相应韶光利用CCK-8避光孵育3.5h后，检测吸光度D(450nm)值并绘制细胞成长曲线。
将Matrigel胶(356234，Solarbio)1∶9稀释后包被8μm孔径、6.5mm直径Transwell小室，培养箱孵育2h后100μL无血清培养基水化小室基底膜30min，无血清培养基重悬各分组PC-3细胞(1×105个/室)接种于小室，不才室加入含FBS的F12培养基。
培养箱中培养24h后，PBS洗濯小室并在体积分数为4%组织细胞固定液固定30min，洗濯晾干后体积分数为1%结晶紫染色20min，洗濯并用棉签擦拭干净，每个小室200倍显微镜随机拍取9个视野，取均值。
迁移实验无需孵育Matrigel胶，其他步骤与侵袭实验相同。
将人TGF-α启动子区核心片段(2000bp)荧光素酶质粒、KLF7过表达质粒和Renilla荧光质粒共转染到96孔板培养的293T细胞中。
利用Dual-Glo○R双荧光素酶报告基因检测系统(E2920)检测细胞内荧光值。
将双Glo荧光素酶测定试剂添加到细胞中，20～25℃下避光孵育10min，然后在全波长扫描多功能微孔板阅读器(BioTeK)中检测萤火虫荧光；将Stop试剂添加到细胞中，20～25℃避光孵育10min，在同一仪器中检测Renilla荧光。
每孔萤火虫荧光/Renilla荧光后，以GLP-Basic-NC组作为对照组将各组数据进行归一化处理后，比较剖析各组间荧光量。
运用SPSS17.0对各组数据进行t考验(正态分布、方差齐的2组计量数据)。
考验水准α=0.05(双尾)。
RNA-seq结果显示，在PC-3细胞中上调KLF7后有1047个差异表达基因，下调KLF7后有1101个差异表达基因，个中有14个基因在上调KLF7后显著高表达，并不才调KLF7后显著低表达，均P<0.05，而TGF-α差异表达最为显著。
进一步利用生物信息学预测创造，TGF-α基因启动子区存在多个KLF7结合位点，因此选择TGF-α作为KLF7下贱的靶基因进行后续实验。
模型ID
名称
评分
干系评分
序列ID
起始
截至
预测序列
MA1959.1
KLF7
9.245370
0.8929577745507349
NC_000002.12:c70553826-70551827
1904
1912
GGGGTGTAG
MA1959.1
KLF7
8.996936
0.8882938165551537
NC_000002.12:c70553826-70551827
1100
1108
GGGGAGGAG
MA1959.1
KLF7
8.651956
0.8818173563459979
NC_000002.12:c70553826-70551827
1273
1281
AGGGTGTAG
MA1959.1
KLF7
8.422842
0.8775161100571693
NC_000002.12:c70553826-70551827
533
541
GGGGCGCAG
免疫组织化学染色结果显示，与BPH(KLF7:0.89±0.26;TGF-α:2.06±0.54)比较，PCa组织中KLF7(2.19±0.45)和TGF-α(2.60±0.39)的蛋白表达水平升高，t值分别为7.989和2.474，P值分别为<0.001和0.024。
并且，受试个体前列腺组织中KLF7与TGF-α表达水平正干系，r=0.403，P=0.078。
转染KLF7过表达质粒48h后，上调KLF7组细胞TGF-α的mRNA表达水平为2.09±0.08，与空缺组(1.00±0.35)比较升高，差异有统计学意义，t=5.345，P=0.006;蛋白质印迹法结果显示，与NC组比较，TGF-α的蛋白表达水平显著升高(图3A)。
同时，上调KLF7可显著促进PC-3细胞的增殖(72h:1.73±0.07 vs 1.90±0.02，t=4.269，P=0.013)、侵袭(57.11±18.68 vs 95.78±30.84，t=3.217，P=0.005)与迁移(121.56±33.67 vs 240.11±36.56，t=7.156，P<0.001)能力。
转染KLF7滋扰片段48h后，下调KLF7组细胞TGF-α的mRNA表达水平为0.36±0.01，与空缺组(1.00±0.17)比较降落，差异有统计学意义，t=6.562，P=0.003;蛋白质印迹法结果显示，与NC组比较，TGF-α的蛋白表达水平降落(图4A)。
同时，下调KLF7可显著抑制PCa细胞的增殖(72h:2.12±0.07 vs 1.77±0.02，t=8.671，P=0.001)、侵袭(210.00±56.73 vs 87.33±16.90，t=5.888，P<0.001)与迁移(208.33±43.44 vs 138.22±33.61，t=3.830，P=0.002)能力。
以上研究结果提示，KLF7可调控TGF-α的表达水平，且高水平KLF7可显著促进PC-3细胞的增殖、侵袭与迁移能力。
利用过表达质粒在PC-3细胞中上调TGF-α后不雅观察PC-3细胞生物学行为的改变。
结果显示，上调TGF-α可显著促进PC-3细胞的增殖(72h:1.90±0.06 vs 2.39±0.03，t=15.442，P<0.001)、侵袭(152.67±8.11 vs 201.22±7.30，t=13.356，P<0.001)与迁移(107.00±27.79 vs 163.00±15.80，t=5.255，P<0.001)能力。
进一步利用滋扰片段在PC-3细胞中下调TGF-α后不雅观察PC-3细胞生物学行为的改变。
结果显示，下调TGF-α可显著抑制PC-3细胞的增殖(72h:2.31±0.07 vs 1.80±0.11，t=6.695，P=0.003)、侵袭(188.44±20.43 vs 108.56±27.96，t=6.922，P<0.001)与迁移(192.11±22.18 vs 110.67±30.67，t=6.456，P<0.001)能力。
在PC-3细胞中上调KLF7同时下调TGF-α的表达，与纯挚上调KLF7组比较，滋扰TGF-α后可显著逆转KLF7对PC-3细胞增殖(72h:2.40±0.11 vs 1.87±0.03，t=8.916，P<0.001)、侵袭(83.67±18.25 vs 61.56±12.10，t=3.029，P=0.008)和迁移(98.78±11.71 vs 60.67±6.00，t=8.688，P<0.001)的促进浸染。
以上研究结果提示，KLF7可通过上调TGF-α的表达显著增强PC-3细胞的生物学行为。
构建TGF-α基因启动子区荧光素酶报告基因质粒，与KLF7过表达质粒共转染至293T细胞24h后创造，与OE-NC组比较，上调KLF7后TGF-α基因启动子区活性并未被激活(1.00±0.17 vs 1.06±0.06)，t=0.704，P=0.508。
提示KLF7不能直接转录激活TGF-α的表达。
PCa对中老年男性的生命康健造成极大的威胁，以雄激素剥夺为主的传统PCa切除术及放化疗方法已不能知足临床患者的需求，仍有不少患者发展为较为严重的耐药和去势抵抗性PCa。
PCa涌现去势抵抗后，患者的预后将急剧恶化，且极易发展难堪以治愈的骨转移性PCa。
因此，阐明发生去势抵抗的详细分子机制，将为筛选治疗去势抵抗性PCa的药物靶标供应理论依据。
Krüppel样因子是一类C末端含3个锌指构造域的转录因子家族，其成员在分子和细胞水平调节胚胎发育、能量代谢及肿瘤发生的浸染已被广泛研究。
本研究在体外培养的去势抵抗性PCa细胞系PC-3中创造，上调KLF7可显著促进细胞的增殖、侵袭与迁移能力，下调KLF7可显著抑制细胞的上述生物学行为；进一步在体外证明了KLF7对PCa细胞生物学行为的促进浸染。
为阐明其发挥匆匆癌浸染的详细分子机制，本研究在PC-3细胞等分别上、下调KLF7后，利用生物信息学方法对RNA-seq结果进行剖析后创造，有14个基因在上调KLF7后显著高表达，而不才调KLF7后显著低表达，个中TGF-α与KLF7的干系性最为显著，且TGF-α基因启动子区存在多个KLF7结合位点。
免疫组化结果显示，KLF7和TGF-α在PCa组织中均显著高表达，且KLF7与TGF-α的表达水平正干系。
进一步上(下)调KLF7后，PC-3细胞中TGF-α的mRNA和蛋白表达水平均升高(降落)，同时促进(抑制)了细胞的生物学行为。
此外，本研究在上调KLF7同时下调TGF-α后，可显著逆转KLF7对PC-3细胞生物学行为的促进浸染。
以上结果提示，TGF-α可能是KLF7促进PCa发生的关键下贱因子。
TGF-α是一种表皮成长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)类似物，可以自分泌或旁分泌的办法在多种肿瘤中高表达，通过与EGF受体结合形成膜二聚体激活STAT1/STAT3、MAPK/NFκB等旗子暗记通路，发挥稳定的匆匆癌浸染。
亦有文献宣布，TGF-α在PCa中高表达。
导致TGF-α高表达的缘故原由，目前尚不完备清楚。
本研究在PCa组织和PC-3细胞中创造，KLF7对TGF-α可能存在正向调控浸染。
然而，双荧光素酶报告基因结果显示，KLF7并不能直接转录激活TGF-α。
前期已创造，转录因子KLF7可激活小鼠脂肪细胞中NF-κB旗子暗记通路。
有研究创造，活化的JNK/NF-κB旗子暗记通路可通过促进EGF和TGF-α高表达致使膀胱尿路上皮细胞恶变。
KLF7是否可通过激活JNK/NF-κB旗子暗记通路上调TGF-α的表达，进而促进PCa的发生发展，还有待进一步研究加以证明。
本研究结果显示，KLF7可通过上调匆匆癌因子TGF-α促进去势抵抗性PCa细胞PC-3的增殖、侵袭和迁移能力。
这将为筛选去势抵抗性PCa的药物浸染靶点，供应新的根本理论和实验依据。
注：A.蛋白质印迹法检测上调TGF-α后PC-3细胞中TGF-α的蛋白表达水平；B.CCK-8检测上调TGF-α后PC-3细胞的增殖能力；C.Transwell检测上调TGF-α后PC-3细胞的侵袭能力(结晶紫染色，×200);D.Transwell检测上调TGF-α后PC-3细胞的迁移能力(结晶紫染色，×200);KLF7.Krüppel样因子7;TGF-α.转化成长因子-α。
