文章标题：
A pathway-focused RT-qPCR array study on immune relevant genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) harboring cecropin P1 transgene
Yueh-Chiang Han，Thomas T.Chen
Fish and Shellfish Immunology（IF=3）
DOI: doi.org/10.1016/j.fsi.2019.03.027
研究背景：
研究抗菌肽P1转基因鱼对微生物病原体传染的抗性。
方法
对实验室已有的不同家族的抗菌肽P1转基因虹鳟鱼取肝、肾、脾等样本共36个，进行qPCR检测（wcgene biotech， 上海启因生物）和基因序列剖析。
结果
1. 转基因脾脏免疫干系通路差异表达基因的剖析
表1.通过RT-qPCR芯片测定转基因鱼（F231，F509和F695）脾脏中的差异表达基因（DEG）情形
图1 三种转基因鱼（F231, F509, F695）中在趋化因子/细胞因子JAK-STAT旗子暗记通路（A）、Toll样受体旗子暗记通路（B）、补体和凝血的通路（C）、抗原加工和呈递（D）、溶酶体/吞噬浸染路子（E）、白细胞跨内皮迁移路子（F）上调、下调表达的基因。
如图1A所示，在所有三个家族中，与导致趋化因子/细胞因子JAK-STAT旗子暗记通路的配体-受体结合干系的基因的表达持续上调；这些基因包括ccr9、cxcr3、cxcr4、cxcl11、cxcl12、il6st和il21r(图1A)。虽然stat1的STAT转录因子(STAT1和stat6)和靶基因(c4)的表达增加，但STAT1的另一个靶基因(irf7)显著降落。虽然ccr8的表达在F231鱼类家族中表现出抑制，但是在F509和F695鱼类家族中表现出增加的表达。在Tolllike受体旗子暗记通路中，三个不同TLR(TLR 2、tlr3和tlr7)、主要衔接子(myd88)、滋扰素调节因子(irf3)及其靶基因(cxcl11)的表达在三个家族中都上调(图1B)。然而，tnfrsf5 (cd40)的irf7和IRF3靶基因的表达受到抑制。在补体和凝集级联路子中，在结合配体(mbl)和三种补体身分(c4、c6和c7)的基因中不雅观察到同等的表达水平升高(图1C)。在抗原处理和呈递路子(图1D)中，逆转录-qPCR阵列数据显示hspa4、hspa5、cd4、calr和b2m中表达水平升高，但是不雅观察到两种紧张组织相容性复合体(MHC)即mhc1和mhc2的下调。此外，组织蛋白酶B和L (ctsb和ctsl)以及溶酶体/吞噬浸染路子中的必需膜糖蛋白(lamp2)持续上调(图1E)。在白细胞跨内皮迁移路子中，三种主要的整合素(itgb1、itgb7和itga4)和粘附配体(cxcl12)以及关键胶原酶(mmp9)被显著刺激(图1F)。
2. 转基因肾脏免疫干系路子差异表达基因的剖析
表2 肾脏中免疫干系路子的DEGs表达水平的结果
图2虽然白细胞跨内皮迁移路子中关键整合素基因(itgb1、itgb7和itga4)和结合配体基因(cxcl12)的基因表达水平显著升高(图2A)，胶原酶基因(mmp9)也上调，但在三种鱼转基因肾脏中不雅观察到调节细胞外基质组织的纤连蛋白(fn1)和层粘连蛋白(lambin 2)基因表达水平的抑制(图2B)。
3. 转基因肝脏免疫干系路子差异表达基因的剖析
表3转基因虹鳟肝脏中的免疫路子干系的DEG的芯片剖析结果
图3 如图3A所示，在三个转基因鱼科中，PPAR旗子暗记传导和脂质代谢过程路子中主要的膜转运蛋白/同工酶（slc27a2）和磷脂转移蛋白（pltp）基因的表达差异性增强。相反，转基因肝脏中旗子暗记受体（ppar-α和rxr-γ）及其下贱靶基因（cyp27a1）的mRNA水平受到抑制。有趣的是，虽然脂肪酸结合蛋白（fabp1）的mRNA水平在F509和F695的转基因鱼科中上调，但它在F231家族中被下调。与花生四烯酸代谢路子干系的DEG被下调，包括cyp2j2和pla2g12b（图3B）。末了，在所有三个转基因家族中，溶酶体/吞噬浸染路子中的组织蛋白酶D和S（ctsd和ctss）被同等地抑制（图3C）。有趣的是，膜糖蛋白基因（lamp2）的表达在转基因鱼科F231和F695中得到增强，但它在家族F509中受到抑制。
结果总结
结果表明除了其直接的杀微生物活性外，抗菌肽P1的转基因产物在转基因宿主中勾引免疫调节活性。
qPCR芯片技能为水产养殖中抗病鱼苗的选育供应了一种快速，有效，廉价的筛选方法。这项研究还可能鼓励进一步探索干系的科学研究课题，如海洋物种中抗菌肽（AMPs）的组织分布，微生物传染效应和蛋白质组学研究。
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